豬用生物制品及相關(guān)豬源原輔材料中非洲豬瘟病毒核酸檢測方法
1 適用范圍
1.1豬用及采用豬源原輔材料制備的生物制品成品及半成品。
1.2豬源毒種。
1.3 豬源細(xì)胞及相關(guān)制品生產(chǎn)用細(xì)胞。
1.4其他豬源原輔材料（如組織、血清、胰酶衍生物等）。
2 取樣和處理
2.1 疫苗
2.1.1 活疫苗 取至少2瓶樣品，按瓶簽注明頭份用適宜稀釋液分別稀釋成10頭份/0.2ml，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。
2.1.2 滅活疫苗 取至少2瓶樣品，等量混合后進(jìn)行以下處理。
2.1.2.1 油佐劑滅活疫苗 取36 ml混合疫苗，加入正戊醇4.0 ml，充分振蕩混合1分鐘，2～8℃冰箱靜置不少于60分鐘，直至油相和水相分離。取水相進(jìn)行核酸提取。
2.1.2.2 水性佐劑滅活疫苗
2.1.2.2.1鋁膠佐劑滅活疫苗 取混合疫苗5.0 ml，搖勻，加入0.25 g解離劑CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸），放入搖床（200 r/min）37℃解離1小時，5000 r/min離心10分鐘，取上清液進(jìn)行核酸提取。
2.1.2.2.2其他水性佐劑滅活疫苗 直接取混合樣品進(jìn)行核酸提取。
2.2 其他生物制品和半成品凍干類制品，按活疫苗進(jìn)行取樣和處理；液體制品及半成品，取至少2份（瓶）樣品，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。
2.3 豬源毒種 取至少2支毒種。凍干毒種，按凍干前體積復(fù)溶后等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提??；非凍干毒種，等量混合后直接取混合液進(jìn)行核酸提取。
2.4 豬源細(xì)胞 除另有規(guī)定外，取至少2瓶細(xì)胞濃度不少于107.0個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液進(jìn)行核酸提取。
2.5 其他豬源原輔材料
2.5.1豬組織 每種組織，分別取樣和處理。取不少于2.0 g組織，研磨后用5倍體積滅菌PBS懸浮，70℃滅活30分鐘，4℃下以2000～3000 g離心10分鐘，取上清液進(jìn)行核酸提取。
2.5.2豬血清 每批血清取至少2個最小包裝的樣品，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。
2.5.3豬胰酶 干粉狀胰酶，取至少2份樣品，根據(jù)使用情況分別配制成不低于2.5%濃度的溶液，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提??；液體胰酶，取至少2個最小包裝的樣品，等量混合，取混合液進(jìn)行核酸提取。
2.5.4其他豬源衍生物 固體、液體或干粉狀豬源衍生物，可分別按組織、血清或干粉狀胰酶的方法進(jìn)行取樣和樣品處理。
3 核酸提取
3.1 試劑和器材
3.1.1試劑 根據(jù)核酸提取方法確定，如氯仿、異丙醇、無水乙醇、0.1 mol/l 檸檬酸鈉（含10%乙醇）、75%乙醇等。
3.1.2儀器 核酸含量測定儀；常溫臺式離心機；旋渦振蕩器；水浴鍋；微量移液器1套（最大量程分別為10 μl、100 μl、200 μl、1000 μl）。
3.1.3耗材 1.5 ml帶蓋離心管、無菌吸頭（0～10 μl、0～200 μl、100～1000 μl）、一次性乳膠手套。
3.2 操作程序（TRIZOL法），也可以選擇其他等效核酸提取方法提取樣品中的DNA。
3.2.1取樣品250 μl，加入750 μlTrizol，顛倒混勻，室溫放置5分鐘。
3.2.2加入200 μl氯仿，充分混勻，室溫放置10 分鐘，4℃下以12000 g離心15 分鐘。
3.2.3棄去上清液，加入220 μl無水乙醇，顛倒混合，15～30℃放置2～3分鐘，2～8℃以2000 g離心5分鐘，沉淀物為DNA。
3.2.4棄去上清液，加入含10%乙醇的0.1 mol/l 檸檬酸鈉750 μl洗滌DNA，15～30℃放置30分鐘，2～8℃以2000 g離心5分鐘。重復(fù)一次。
3.2.5加入75%乙醇1.2 ml，重懸DNA沉淀，15～30℃放置20分鐘，4℃2000 g離心5分鐘?？芍貜?fù)一次，充分洗滌DNA沉淀。
3.2.6棄去上清液，敞開離心管管口，在空氣中干燥5～10分鐘，加入30～50 μl的無核酸酶滅菌水溶解DNA，－20℃以下保存?zhèn)溆谩?/span>
3.3 注意事項
3.3.1核酸提取試劑具有腐蝕和強變性能力，應(yīng)做好個人防護(hù)，佩戴手套、口罩和護(hù)目鏡，防止液體飛濺到皮膚和眼睛。
3.3.2后續(xù)的核酸檢測敏感性很高，要防止樣品之間相互污染，最好使用帶濾芯的槍頭，且每次吸取取液體時均需更換槍頭。
3.3.3為防止核苷酸降解，應(yīng)避免核酸酶污染，使用的耗材均需無核酸酶。
3.3.4做好剩余樣品的無害化處理及操作臺面的消毒處理。剩余樣品可通過高壓滅菌或煮沸處理，也可放在1%衛(wèi)可或2%氫氧化鈉消毒液中浸泡處理，操作臺面使用1%衛(wèi)可擦拭。
3.3.5提取后的DNA樣品要用錫箔紙封存，取樣時應(yīng)用槍頭直接刺破錫箔紙取樣，防止污染。
4 檢測
下列兩種方法可任選其一。
4.1 實時熒光定量PCR檢測法
4.1.1試劑和器材
4.1.1.1 試劑
4.1.1.1.1 熒光定量PCR試劑 本操作中以AppliedBiosystems TaqMan Gene Expression Assays kit為例，也可選用其他熒光定量PCR試劑。
4.1.1.1.2 擴增引物及探針擴增引物：
ASF-05-Zsak-1466F（10μmol/L）：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'
ASF-05-Zsak-1528R（10μmol/L）：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'
探針ASF-05-Zsak-1486prob(10μmol/L)：5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'
4.1.1.1.3 無核酸酶的滅菌水 PCR級別。
4.1.1.2 儀器 熒光定量PCR儀；微量移液器1套（最大量程分別為10μl、100 μl、200 μl、1000 μl）。
4.1.1.3 耗材 1.5ml帶蓋離心管、0.2 ml薄壁PCR管、熒光定量PCR 96孔板、0.1 ml熒光PCR八連管、無菌吸頭（0～10 μl、0～200 μl、100～1000 μl）、一次性乳膠手套。
4.1.2 操作程序
4.1.2.1 樣品DNA制備 按照前述方法進(jìn)行核酸提取。
4.1.2.2 反應(yīng)體系的配制 配制比樣品數(shù)量至少多4個的反應(yīng)體系，同時設(shè)置強陽性、弱陽性和陰性對照。在強陽性和弱陽性對照反應(yīng)管中分別加入含有非洲豬瘟P72基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA各3 μl，在陰性對照反應(yīng)管中加入3μl無核酸酶滅菌水。每個PCR反應(yīng)管中應(yīng)包含以下成分：
|
成分
|
體積（μl）
|
|
2×ABI TaqMan Gene ExpressionMix
|
10
|
|
ASF-05-Zsak-1466F（10 μmol/ L）
|
1
|
|
ASF-05-Zsak-1528R（10 μmol/ L）
|
1
|
|
探針(10 μmol/ L)
|
0.8
|
|
DNA
|
3
|
|
無核酸酶滅菌水
|
4.2
|
|
總量20
|
4.1.2.3 反應(yīng)程序 將所有待檢樣品和強陽性、弱陽性、陰性對照反應(yīng)管放在熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴增：50℃2分鐘，95℃5分鐘，95℃15秒，58℃退火延伸1分鐘，45個循環(huán)（熒光信號收集在此階段每次循環(huán)的退火延伸時進(jìn)行）。
4.1.2.4 結(jié)果判定
4.1.2.4.1 閾值設(shè)定 試驗操作結(jié)束后，確定Ct值。Ct值為每個樣品反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
閾值設(shè)定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點為準(zhǔn)。
4.1.2.4.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
對照組的檢測結(jié)果應(yīng)符合以下情況，此次檢測方為有效：
陰性對照無Ct 值，且無擴增曲線。
強陽性對照的Ct 值應(yīng)在18～22之間，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。弱陽性對照的Ct 值應(yīng)在33～35之間，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。
4.1.2.4.3 判定
陰性：無Ct值，且未出現(xiàn)擴增曲線，判定為樣品中無ASFV核酸。
陽性：Ct值≤40，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，判定為樣品中存在ASFV核酸。
可疑：Ct值>40，且出現(xiàn)典型擴增曲線，判定為可疑，應(yīng)重檢。重檢后，Ct值≤40且出現(xiàn)典型擴增曲線者判為陽性，其他情況均判定為陰性。
4.2 普通 PCR檢測法
4.2.1 試劑和器材
4.2.1.1 試劑
4.2.1.1.1 PCR試劑 10×PCR緩沖液（含25 mmol/l Mg2+），DNA擴增酶，dNTP預(yù)混液。
4.2.1.1.2擴增引物
primer PPA-1（10 μmol/L）：5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3' (上游引物)；
